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Identificação dos mecanismos de regulação das células Natural Killer pelo fator de transcrição C/EBPG (CCAAT/enhancer binding protein gamma) (2018)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: LOPES, IZABELA APARECIDA - FMRP
  • USP Schools: FMRP
  • Sigla do Departamento: RCM
  • Subjects: ONCOLOGIA; CÉLULAS; EXPRESSÃO GÊNICA; DEFICIÊNCIAS
  • Keywords: C/EBPG transcription factor; Natural Killer cells; IFNy; Fator de transcrição C/EBPG; Células Natural Killer
  • Language: Português
  • Abstract: Os C/EBP (CCAAT/enhancer-binding proteins) são uma família de fatores de transcrição implicados numa variedade de processos da hematopoese, regulando tanto a diferenciação terminal como a proliferação celular. Dentre estes, sabe-se que o C/EBP gamma (C/EBPG) está envolvido na maturação funcional de células Natural Killer (NK). Entretanto, os mediadores dessa regulação não são conhecidos. As células NK são linfócitos com funções efetoras de citotoxicidade e de produção de citocinas, dependentes de um equilíbrio dinâmico entre a expressão de receptores ativatórios e inibitórios bem como de receptores de citocinas. As duas funções (citotóxica e secretora), fazem das células NK importantes componentes da hematopoese, capazes de eliminar alvos susceptíveis bem como de recrutar outras células e amplificar a resposta inflamatória. Diante de incompatibilidade entre as células-alvo e células NK efetoras, os efeitos citotóxicos preponderam; enquanto na ausência de incompatibilidade, os efeitos mediados por citocinas sobre as demais células hematopoéticas se sobressaem. Por exemplo, citocinas como IFN?, TNF?, TGF?, GM-CSF e IL-10, produzidas por células NK, são potenciais reguladoras da função das células-tronco hematopoéticas (CTH). Com o objetivo de estudar a regulação das células NK pelo C/EBPG, utilizamos células NK isoladas de animais transgênicos knockout (KO) para o C/ebpg e seus controles para analisar sua expressão gênica e função diferencial, com especial foco nos genes-alvocom potencial para regulação da hematopoese. Visando identificar potenciais genes-alvo do C/EBPG, isolamos células NK deficientes para o C/ebpg e controles, por meio de sorting, e realizamos posterior isolamento do RNA seguido de análise de expressão gênica em larga escala. A validação da expressão diferencial dos genes-alvo do C/ebpg, de interesse para a função secretória das células NK, foi realizada por PCR em Tempo Real para oito genes diferencialmente expressos na análise de expressão gênica em larga escala, a saber: Il-10, Gmcsf, Ifng, Tnfa, Tgfb, Tlr4, Myd88 e Irak4. Os dados referentes à expressão basal e estimulada com IL-2, destes genes em células NK de animais KO para o C/ebpg e seus controles, revelaram uma tendência ao aumento da expressão de Myd88 nos animais KO quando comparados aos controles. Foram verificados os níveis das citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF? and IFN? por meio de citometria de fluxo, utilizando o sobrenadante da cultura de NK de ambos os animais, observando-se que, após a ativação com IL-2, a produção de IFN? mostrou-se diminuída em células NKdeficientes para o C/ebpg em comparação aos controles. Para caracterizar as células NK Cebpg-deficientes, analisamos a sua frequência (células linhagem-/CD3- /NK1.1+) e expressão dos receptores NKG2D, Ly49D e NKG2A, não sendo observadas diferenças numéricas ou de expressão de receptores entre células NK deficientes ou não para o C/ebpg. Os subtipos funcionais destas células foramcaracterizados de acordo com a expressão de CD27 e CD11b, que permitem identificar as subpopulações de células NK imaturas secretórias, secretórias, citotóxicas e tolerantes. Os animais KO mostraram maior percentagem de células secretórias e redução percentual e numérica de células citotóxicas quando comparadas às células NK dos controles. Para demonstrar a deficiência funcional realizamos um ensaio de ativação de células. Em concordância, após a coincubação de esplenócitos totais com células YAC-1, o ensaio de detecção do CD107 revelou que as células dos animais KO para o C/ebpg são cinco vezes menos ativadas do que células NK controles. Ademais, foi realizado um ensaio de citotoxicidade por citometria de fluxo utilizando o CTO (Cell Tracker Orange) como sonda fluorescente, o qual se incorpora às células-alvo da linhagem YAC-1. Como resultado, para a razão 10:1 NK: células-alvo, as células NK C/ebpg KO foram menos citotóxicas do que as células NK dos controles. Concluímos que as células NK de animais transgênicos KO para o C/ebpg têm função deficiente, menor potencial citotóxico e expressão de genes e citocinas alteradas em relação aos seus controles. Os mediadores apontados, em especial, o IFN?, são alvos importantes para a regulação da função secretória das células NK
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 05.07.2018
  • Acesso online ao documento

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    • ABNT

      LOPES, Izabela Aparecida; PONTES, Lorena Lobo de Figueiredo. Identificação dos mecanismos de regulação das células Natural Killer pelo fator de transcrição C/EBPG (CCAAT/enhancer binding protein gamma). 2018.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2018. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17154/tde-13092018-145344/ >.
    • APA

      Lopes, I. A., & Pontes, L. L. de F. (2018). Identificação dos mecanismos de regulação das células Natural Killer pelo fator de transcrição C/EBPG (CCAAT/enhancer binding protein gamma). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17154/tde-13092018-145344/
    • NLM

      Lopes IA, Pontes LL de F. Identificação dos mecanismos de regulação das células Natural Killer pelo fator de transcrição C/EBPG (CCAAT/enhancer binding protein gamma) [Internet]. 2018 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17154/tde-13092018-145344/
    • Vancouver

      Lopes IA, Pontes LL de F. Identificação dos mecanismos de regulação das células Natural Killer pelo fator de transcrição C/EBPG (CCAAT/enhancer binding protein gamma) [Internet]. 2018 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17154/tde-13092018-145344/

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