Desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos e humanizados anti-flavivírus com potencial neutralizante: prospecção, caracterização e uso em diagnóstico e terapia (2022)
- Authors:
- Autor USP: COSTA, HERNAN HERMES MONTEIRO DA - BIOTECNOLOGIA
- Unidade: BIOTECNOLOGIA
- Subjects: ANTICORPOS MONOCLONAIS; FLAVIVIRUS; ZIKA VÍRUS; VÍRUS DE RNA; PROTEÍNAS RECOMBINANTES; WESTERN BLOTTING; TESTES IMUNOLÓGICOS; ELISA
- Keywords: Anticorpos monoclonais; Flavivirus; Flavivírus; Monoclonal antibodies; Phage display; Phage display; scFv; scFv; Vírus Zika; Zika virus
- Language: Português
- Abstract: O vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus emergente da família Flaviviridae, e um problema atual em todo o mundo, principalmente devido às síndromes congênitas e neurológicas associadas a ele. Como os sintomas clínicos iniciais das doenças causadas pelos flavivírus são muito semelhantes, o diagnóstico clínico é difícil. Ainda, há grande complexidade em obter testes diagnósticos específicos e sensíveis, devido à alta similaridade antigênica entre estes arbovírus, e o tratamento por meio de imunoterapias representa um grande desafio, e ainda não foram alcançados. Sendo assim, esforços para a obtenção e avaliação de insumos como possíveis candidatos ao desenvolvimento de testes rápidos ou para uma imunoterapia se fazem necessários. Nesse trabalho, foi realizado a expressão, purificação e caracterização da proteína de envelope recombinante de ZIKV (rEZIKV) e quatro anticorpos recombinantes humanos do tipo scFv (single chain variable fragment) com especificidade ao ZIKV. Previamente, foi realizado três estratégias de biosseleções por Phage Display pelo nosso grupo, a partir do uso de bibliotecas de anticorpos recombinantes Fab expressos em fagos filamentosos, possibilitando a obtenção de milhares de sequências distintas por meio do sequenciamento de próxima geração (NGS) das regiões variáveis das cadeias leves e pesadas de anticorpos. Na primeira estratégia, foi realizado a seleção diretamente contra ZIKV, sem pré-adsorção contra outro flavivírus.Na segunda e terceira estratégia, as sequências foram selecionadas por meio de uma abordagem subtrativa de seleção negativa e positiva contra vírus Dengue sorotipo 2 (DENV2) e ZIKV, respectivamente. Inicialmente foi realizado a expressão da proteína rEZIKV em E. coli a fim de produzir antígenos para a validação dos anticorpos monoclonais. Foi utilizado um biorreator Airlift com volume de 5 L e purificação em coluna de níquel em um sistema automatizado de cromatografia. A proteína rEZIKV teve rendimento de 20mg/L e manteve sua antigenicidade e imunogenicidade. Posteriormente, com base em análises do programa ATTILA, usando como parâmetro de escolha o enriquecimento das sequências após cinco ciclos de biosseleção, foram escolhidas quatro sequencias de scFvs anti-ZIKV. As sequencias gênicas foram sintetizadas e clonadas em vetor pET-SUMO e expressadas em sistema heterólogo de células bacterianas, purificados por afinidade em um sistema de cromatografia automatizado. Foi demonstrado que os quatro scFvs se ligam à proteína rEZIKV e às partículas maduras de ZIKV tanto por ELISA quanto por western blot.Ainda, outros quatro scFvs anti-ZIKV da segunda e terceira estratégia foram selecionados pelo programa ATTILA, sintetizados e clonados em vetor pCOd600, que contém a sequência Fc de IgG1 humana, gerando um anticorpo no formato FvFc. Desta forma, avançamos na criação e caracterização de um banco de anticorpos monoclonais recombinantes a fim de estabelecer estratégias para o desenvolvimento de diagnóstico diferencial oumesmo imunoterapias para o tratamento de infecções geradas pelo ZIKV. Os novos insumos gerados neste trabalho parecem ser promissores e novos ensaios serão realizados a fim de avaliar a viabilidade para sua utilização no manejo de infecções por ZIKV.
- Imprenta:
- Data da defesa: 01.08.2022
-
ABNT
COSTA, Hernan Hermes Monteiro. Desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos e humanizados anti-flavivírus com potencial neutralizante: prospecção, caracterização e uso em diagnóstico e terapia. 2022. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2022. Disponível em: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-24102023-112317/. Acesso em: 29 maio 2024. -
APA
Costa, H. H. M. (2022). Desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos e humanizados anti-flavivírus com potencial neutralizante: prospecção, caracterização e uso em diagnóstico e terapia (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-24102023-112317/ -
NLM
Costa HHM. Desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos e humanizados anti-flavivírus com potencial neutralizante: prospecção, caracterização e uso em diagnóstico e terapia [Internet]. 2022 ;[citado 2024 maio 29 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-24102023-112317/ -
Vancouver
Costa HHM. Desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos e humanizados anti-flavivírus com potencial neutralizante: prospecção, caracterização e uso em diagnóstico e terapia [Internet]. 2022 ;[citado 2024 maio 29 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-24102023-112317/
How to cite
A citação é gerada automaticamente e pode não estar totalmente de acordo com as normas
