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Tese

Aplicação da tecnologia portátil de sequenciamento MinION para análise do metagenoma viral (2023)

  • Authors:
  • Autor USP: ZUCHERATO, VICTORIA SIMIONATTO - FMRP
  • Unidade: FMRP
  • Sigla do Departamento: RCM
  • DOI: 10.11606/D.17.2023.tde-16102023-115348
  • Subjects: SEQUENCIAMENTO GENÉTICO; GENOMAS; VÍRUS; TECNOLOGIAS DA SAÚDE
  • Keywords: Metagenômica; Metagenomics; Nanopores; Nanoporos; Optimization; Padronização; Pré-processamento; Pre-processing; Viruses
  • Agências de fomento:
  • Language: Português
  • Abstract: As tecnologias de Sequenciamento de Nova Geração (SNG) mostraram um crescimento acelerado nos últimos anos. Uma das principais aplicações do SNG é a metagenômica, que identifica patógenos emergentes para os quais não há diagnóstico estabelecido. Uma técnica promissora e de custo relativamente baixo é a tecnologia portátil MinION. Um dos maiores problemas da plataforma MinION é a falta de protocolos otimizados (pré-preparo da amostra, concentração viral, extração e amplificação). Portanto, o objetivo desse trabalho é padronizar e otimizar os procedimentos de metagenômica viral aplicados ao sequenciamento de nanoporos. O controle do sequenciamento foi realizado utilizando vírus RNA (bolsa de sangue positiva para HIV, cycle threshold - Ct=25,8) e vírus DNA (citomegalovírus humano cultivado). Estes controles foram utilizados para padronizar os processos de concentração viral, extração e preparo de bibliotecas metagenômicas. Inicialmente, após a degradação enzimática do material do hospedeiro, foi realizada a concentração viral por ultracentrifugação, que foi consequentemente confirmada com microscopia eletrônica de transmissão. Além disso, foi realizada a concentração viral por método químico utilizando poliacrilamida linear. As amostras concentradas foram extraídas com dois kits diferentes a fim de comparação: QIAamp UltraSens Virus (QIAGEN) e High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume (Roche Life Science). Em seguida, comparamos diferentes métodos de fragmentação do DNA: fragmentação mecânica (Covaris), fragmentação química (endonucleases), amplificação pelo sistema de primer SMART-9N e amplificação isotérmica sem ligação dos fragmentos. Todas as amostras foram sequenciadas utilizando a flow cell 9.4.1 no dispositivo MinION. Na microscopia eletrônica de transmissão visualizamos várias partículas de HIV (tamanho esperado 80-100 nm)bem como uma abundância de fagos, que mostrou a importância da concentração viral. Em seguida, a análise bioinformática revelou que as amostras concentradas por LPA, extraídas pelo kit QIAamp UltraSens Virus e amplificadas pelo método SMART-9N apresentaram maior abundancia viral e número elevado de leituras dos vírus tidos como controles (HIV e CMV). Portanto, propusemos que a metagenômica por sequenciamento de nanoporos seja feita utilizando esses métodos e concluímos que a padronização de todos os procedimentos de pré-processamento de amostras é crucial para melhores resultados de sequenciamento utilizando a tecnologia MinION, que permitirá sua aplicação na área de metagenômica viral e na descoberta de patógenos virais desconhecidos ou reemergentes
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 06.06.2023
    • Acesso à fonteAcesso à fonteDOI
    Informações sobre o DOI: 10.11606/D.17.2023.tde-16102023-115348 (Fonte: oaDOI API)
    • Este periódico é de acesso aberto
    • Este artigo é de acesso aberto
    • URL de acesso aberto
    • Cor do Acesso Aberto: gold
    • Licença: cc-by-nc-sa
    How to cite
    A citação é gerada automaticamente e pode não estar totalmente de acordo com as normas

    • ABNT

      ZUCHERATO, Victoria Simionatto. Aplicação da tecnologia portátil de sequenciamento MinION para análise do metagenoma viral. 2023. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2023. Disponível em: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17153/tde-16102023-115348/. Acesso em: 03 jun. 2024.

    • APA

      Zucherato, V. S. (2023). Aplicação da tecnologia portátil de sequenciamento MinION para análise do metagenoma viral (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17153/tde-16102023-115348/

    • NLM

      Zucherato VS. Aplicação da tecnologia portátil de sequenciamento MinION para análise do metagenoma viral [Internet]. 2023 ;[citado 2024 jun. 03 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17153/tde-16102023-115348/

    • Vancouver

      Zucherato VS. Aplicação da tecnologia portátil de sequenciamento MinION para análise do metagenoma viral [Internet]. 2023 ;[citado 2024 jun. 03 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17153/tde-16102023-115348/

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